Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3 - Журнал «Домашняя лаборатория»

параллельно поверхности капилляра приложено электрическое поле, то оно притягивает противоионы из подвижного слоя вдоль оси и засасывает жидкость в капилляр. Поэтому в случае кварцевых капилляров электроосмотический поток направлен к катоду. Образуется очень плоский профиль потока. Это приводит к значительно меньшему уширению пиков, чем при гидродинамическом течении, при котором образуются сильно зависящие от радиуса капилляра и скорости течения параболические профили потока — профили Хагена-Пуазейля (рис. 4).

Рис. 4. Профиль ЭОП, обусловленный давлением (а), и идеальный профиль (Ь).

В капиллярах, загруженных стеклянными шариками или частицами силикагеля, ЭОП не должен зависеть от диаметра частиц, и направление потока в загруженном капилляре должно быть таким же, как и в пустом. При этом нет необходимости в применении очень маленьких частиц (с диаметром около 1 мкм или даже меньше) или длинных колонок, как при хроматографических методах. Поэтому метод ЭХ вызывает все возрастающий интерес, так как он сочетает селективность ВЭЖХ с высокой разделительной способностью КЭ. Благодаря применению непористых частиц можно исключить влияние диффузии в поры на уширение полос или пиков.

Величина ЭОП может быть упрощенно описана с помощью так называемого уравнения Гельмгольца.

u = ε∙E∙ξ/4∙π∙η

Она пропорциональна диэлектрической проницаемости ε, напряженности приложенного поля Е и количеству зарядов на стенке капилляра или возникающему при этом ξ-потенциалу и обратно пропорциональна вязкости электролита η. В кварцевых капиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролита и добавлении органических компонентов и возрастает с увеличением степени диссоциации поверхностных силанольных групп, что означает увеличение ЭОП с возрастанием значений pH (рис. 5).

Рис. 5. Зависимость электроосмотического потока от pH.

Условия: внутренний диаметр капилляра 75 мкм, L = 40/47 см, буфер: фосфат 10 мМ, нейтральный маркер: бензиловый спирт: Е = 425 В/см.

Если же при добавлении катионных поверхностноактивных веществ (ПАВ) к разделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируется положительный заряд (см. рис. 6), то ЭОП меняет направление и переносит разделительный буфер в направлении анода.

Рис. 6. Адсорбция катионных ПАВ на стенке капилляра.

Зависимость ЭОП в кварцевых капиллярах от значений pH и соответствующая воспроизводимость подвижности представлены на рис. 5. ЭОП проявляет при циклическом обмене буферов типичный эффект гистерезиса. Наибольшие отклонения наблюдаются в средней области pH при значениях, близких к значению рН кремневой кислоты. Благодаря увеличению времени кондиционирования в зависимости от изменений значений pH буфера удается несколько уменьшить это отклонение, и явления гистирезиса уменьшаются. Для воспроизводимости работ с незагруженными капиллярами необходимо при обмене буферов стандартизовать время заполнения и кондиционирования с тем, чтобы можно было устранить явление гистерезиса ЭОП.

Как уже упоминалось, ЭОП уменьшается по мере возрастания ионной силы. При этом зависимость ЭОП от логарифма концентрации буфера носит линейный характер (рис. 7).

Рис 7. Концентрационная зависимость ЭОП.

Условия: кружок — боратный буфер, квадрат — фосфатный буфер (в каждом случае pH 8.0). А: ЭОП в зависимости от In концентрации буфера; В: ЭОП в зависимости от In ионной силы буфера.

ЭОП присутствует во всех электрофоретических методах разделения, так как никогда не удается полностью исключить возникновение поверхностных зарядов. Он может привести, с одной стороны, к концентрационному перемещению электрофоретических зон, однако, с другой стороны, играет существенную и иногда решающую роль при переносе зон через капилляр. Из-за постоянно существующего ЭОП при капиллярном электрофорезе детектор во всех случаях располагается в непосредственной близости от катода.

Анионы сами переносятся к катоду, соответственно скорость их электрофоретического перемещения ниже, чем скорость ЭОП. Таким образом, ЭОП позволяет проводить разделение катионных и анионных соединений в одном анализе (сравни с рис. 2). При других методах капиллярного электрофореза (например, при мицеллярной электрохроматографии) ЭОП используется исключительно для переноса проб (частично незаряженных) к детектору.

Благодаря химической модификации поверхности капилляров, ЭОП может контролироваться, исключаться или даже обращаться. Определение значения ЭОП служит единственной возможностью определить изменения на поверхности капилляров, например, благодаря необратимой адсорбции компонентов пробы. Все другие методы характеристики поверхности капилляров исключаются при очень небольших поверхностях (1 см2). Поверхностно-модифицированные капилляры не проявляют явлений гистерезиса при смене буферов и из-за незначительной адсорбции очень хорошо подходят для анализа белков (см. ниже).

За счет добавления длинноцепочечных катионных детергентов, таких как, например, цетилметиламмониевые соли, которые адсорбируются на силанольмых группах поверхности, можно осуществить даже обращение ЭОП. При этом образуется двойной слой детергента, обращенный положительным зарядом в направлении электролита. При использовании капилляров с такими покрытиями удается осуществлять разделение быстро перемещающихся неорганических ионов. Таблица 1 дает представление о возможностях влияния на ЭОП.

Изменение концентрации буфера представляется наиболее эффективной и простой возможностью влиять на ЭОП разделительной системы. Чтобы оценить действие концентрации буфера на разделение, было проведено разделение тест-смеси, содержащей ионы с различными отрицательными зарядами в боратном буфере с концентрацией от 5 мМ до 100 мМ как при постоянном токе, так и при постоянном напряжении.

Результаты испытаний представлены на рис. 8 и 9.

Рис. 8. Разделение тестовой смеси анионов при постоянном напряжении.

Условия: прибор — Весkmаn Р/АСЕ 2000; капилляр -75 мкм, поле: 227 В/см; буфер — борат, pH 9.5; ввод пробы — давлением, 2 с.; детектирование — 214 им; проба — бензоловый спирт (1), бензойная кислота (2), фталевая кислота (3), 1,3,5-бензолтрикарбоновая кислота (4).

Рис. 9. Разделение тестовой смеси анионов при постоянном токе.

Условия: прибор — Beckman Р/АСЕ 2000; капилляр — 75 мкм; поле — варьируется; буфер — борат, pH 9.5; ввод пробы — давлением, 2 с.; детектирование — 214 нм; проба — бензоловый спирт (1), бензойная кислота (2), фталевая кислота (3), 1,3,5-бензолтрикарбоновая кислота (4).

Благодаря этим измерениям было четко показано, что ЭОП увеличивается по мере уменьшения концентрации буфера и поэтому подходит для анализа сильно отрицательно заряженных, мигрирующих против ЭОП проб. При постоянном напряжении (10 кВ) и концентрации буфера 5 мМ бензолтрикарбоновая кислота еще может быть обнаружена, однако при том же самом времени анализа и концентрации буфера 50 мМ можно детектировать только бензойную кислоту При этом ток повышается с 10 до 130 мА. Аналогичное поведение можно наблюдать для веществ, подвергаемых разделению при постоянном токе (100 мА). Работая с буфером 10 мМ при 26 кВ, в течение 8 минут можно обнаружить все четыре тестовых вещества, в то время как в буфере 50 мМ удается детектировать только нейтральный маркер (бензиловый спирт). В этом буфере при максимальной силе тока 100 мА можно достигнуть