Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3 - Журнал «Домашняя лаборатория»

это приводит к очень малым временам анализа при высоком разрешении. Различие между немодифицированным и покрытым капилляром продемонстрировано на рис. 84.

Рис. 84. Разделение энантиомеров гексабарбитала в капилляре с покрытием (А) и без покрытия (В).

Условия разделения: 0.1 М ТЕЕ, pH 8.3, детектирование при 214 нм; ввод пробы: 1 с, 2 кВ, об. 1.56%р-ЦД, t=25 °C. А) Покрытие капилляра: 4 % линейный полиакриламид, Е=710 В/см (выход заземлен), L-7/27 см. В) Капилляр без покрытия, Е=400В/см. Ь=50/57 см.

Заметно более высокая эффективность для непокрытого капилляра основана на том, что ЭОП перекрывает подвижность анализируемых веществ, и они очень быстро проходят через детектор. Здесь ясно видно, что более высокая производительность за более короткое время при разделении достигается при применении покрытого капилляра. Использование покрытого капилляра в выборе подходящего хирального селектора играет большую роль, так как в данном случае можно много быстрее определить применимость данного селектора, т. е. его селективность.

11.4. Выбор подходящего LLQ

При использовании ЦД в качестве хиральных селекторов решающее влияние на селективность оказывает не только тип ЦД, но и тип заместителя в производных ЦД. Растворимость ЦД в воде также может резко увеличиться при применении производных. Это показано для тестовой смеси различных типов ЦД и их производных на рис. 85.

Рис. 85. Разделительный потенциал различных типов ЦД.

Условия разделения: L=50/57 см, Е= 350 В/см, буфер: 0.1 М ТВЕ, pH 8.3; детектирование при 214 нм, об. 1.5 % ЦД; пробы: 1 — d,1-гексабарбитал, 2 — (!1-дансил-фенидаланин; А) α-ЦД, В) гидроксилропил — α-ЦД, С) метил — β-ЦД, D) гидроксипропил-Р-ЦД.

11.5. Оптимизация концентрации ЦД

Следующая важная составная часть оптимизации состоит в установлении подходящей концентрации ЦД. В зависимости от типа анализируемых веществ с ростом концентрации ЦД могут наблюдаться улучшение разрешения, потеря или даже инверсия разрешения. Это может приводить к неправильным выводам о различных механизмах разделения энантиомеров с помощью ЦД. На рис. 86 показано влияние концентрации ЦД на разделение энантиомеров.

Рис. 86. Влияние концентрации гидроксипропил — р-ЦЦ на разрешение пиков при разделении производных дигидропиридина.

Условия разделения: L=50/57 см, Е=350 В/см; буфер: 0.1 М Т BE, pH 8.3, различные концентрации ЦД, детектирование при 214 нм.

В немодифицированной с помощью ЦД буферной системе отрицательно заряженные энантиомеры обладают высокой подвижностью относительно ЭОП, так как они без сопротивления могут проходить сквозь буфер (нижняя электрофореграмма).. Уже небольшие добавки хирального селектора вызывают сильное уменьшение подвижности анализируемых веществ, причем в этом случае наблюдается вполне Достаточная селективность. Разделение при очень низких концентрациях ЦД объясняется различным временем пребывания D- и L-форм в ЦД. Энантиомер с большим временем пребывания в ЦД проявляет меньшую подвижность и детектируется ближе к ЭОП.

Дальнейший рост концентрации хирального селектора может резко ограничить подвижность анализируемых веществ, так что они; Детектируются очень близко к ЭОП. В этом случае из-за слишком малой зоны движения разделение энантиомеров может стать невозможным. Кроме того, при повышении концентрации ЦД растет вязкость буфера, что замедляет ЭОП и увеличивает время анализов. В капиллярах с заторможенным ЭОП рост концентрации ЦД также приводит к уменьшению подвижности анализируемых веществ, повышению вязкости буферной системы и, вследствие этого, к увеличению времени анализов.

Наряду с уменьшением разрешения вследствие небольшого времени пребывания в капилляре при высоких концентрациях ЦД могут наблюдаться также и другие эффекты. В некоторых случаях оказывается, что уже при очень низких концентрациях ЦД наблюдается хорошее разделение пар энантиомеров (разрешение больше 1.5). Однако, при более высоких концентрациях хирального селектора (об. 4-10 %) разрешение снова падает. При более высоких концентрациях ЦД время пребывания D- и L-форм анализируемых веществ в ЦД увеличивается, однако разность этих времен постоянно уменьшается.

Тем самым, разрешение пиков при разделении в этой системе уменьшается или даже совершенно исчезает. Экстремальный случай оптимизации концентрации ЦД приведен на рис. 87.

Рис. 87. Изменение последовательности выхода энантиомеров при различных концентрациях ЦД.

Условия разделения (слева): L=50/57 см, Е=350 В/см, 20 мМ фосфатный буфер, pH 7.7 с об. 0.5 % гидроксипропил-fr-ЦД. (Справа): L=80/87cm, Е=30 В/см, 20 мМ фосфатный буфер, pH 7.0 с об. 15 % гидроксипропил-Р-ЦД; детектирование при 214 нм.

При очень низких концентрациях хирального селектора в системе достигается хорошая селективность. Если повысить концентрацию, разрешение полностью исчезает и снова появляется при очень высоких концентрациях ЦД. Это показано на рис. 88, где представлены зависимости относительных времен миграции от концентрации ЦД.

Рис. 88. Зависимость относительных времен миграции D- и L-дансил-фенилаланина от концентрации гидроксипропил — Р-ЦД.

Хорошо видно, что относительная миграция с ростом концентрации ЦД резко падает и примерно при об. 6 % достигает минимума. В этой области разрешение зависит только от различия времен нахождения D- и L-форм в ЦД. При концентрациях больше об. 6 % подвижность анализируемых веществ практически не изменяется. Следует отметить, что разрешение снова возрастает при концентрациях ЦД больше об. 12 %. Это можно объяснить только тем, что при высоких концентрациях образуются диастереомерные комплексы между ЦД и анализируемым веществом. Диастереомеры по своей природе проявляют различные физические свойства, и поэтому их можно разделить. Из-за различия механизмов разделения в начале и конце кривых последовательность выхода энантиомеров неизбежно обращается.

11.6. Оптимизация значений pH

Значение pH в КЭ является одним из важнейших параметров оптимизации. С помощью значений pH можно не только воздействовать на ЭОП, но и перевести анализируемые вещества в определенную ионную форму. Из этого вытекают различные электрофоретические подвижности, которые приводят затем к разделению анализируемых веществ. Если используются незаряженные ЦД, пара энантиомеров при определенном pH должна иметь такую собственную подвижность, чтобы смогла пройти сквозь псевдостационарную фазу (в данном случае — ЦД).

На рис. 89 в качестве примера представлена зависимость разделения рацемированной смеси от значения pH. При низких значениях pH анализируемые вещества практически не обладают собственной подвижностью и проходят через детектор со скоростями, близкими к ЭОП, не разделяясь. Из рис. 89 также видно, что при низких значениях pH ЭОП очень мал.

Рис. 89. Влияние значений pH на разделение производных дигидропиридииа.

Условия разделения: L=50/57cm, Е=440 В/см, буфер: 20 мМ фосфат, об. 0.4 % гидроксипропил-р-ЦД, различные значения pH; детектирование при 214 нм.

При средних значениях pH анализируемые вещества обладают достаточно высокой собственной подвижностью, так что в этом случае различие в подвижности между D- и L-формами может привести к переносу. Анализируемые вещества в данном случае должны пройти достаточно большой эффективный участок пути в капилляре. Потеря