Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №4 - Журнал «Домашняя лаборатория»

молекула состоит из 4,6 млн. пар нуклеотидов, что соответствует молекулярной массе 3х106 Да. Длина молекулы составляет порядка 1.5 мм. Время репликации этой молекулы 20 мин. Есть бактерии, которые размножаются медленнее, чем кишечная палочка.

Структура бактериальной ДНК как кольцевой была предложена в 1956 году Жакобом и Вольманом. Это было революционное предположение, так как до этого считалась, что ДНК линейная. Но революция во взглядах произошла еще раз, когда выяснилось, что геном бактерии может быть представлен как кольцевой, так и линейной молекулой ДНК. Кроме основной молекулы ДНК у нее могут встречаться (а могут и отсутствовать) плазмиды — небольшие (3–5 тысяч нуклеотидов) кольцевые или линейные ДНК, часто несущие гены устойчивости к антибиотикам и другие необязательные системы. Именно из-за наличия плазмид (а они способны передаваться горизонтально от клетки к клетке, даже между бактериями разных видов), распространение устойчивости к антибиотикам происходит очень быстро между всеми бактериями, живущими в одном месте.

То есть в состав генома бактерий могут входить как кольцевые, так и линейные молекулы ДНК. И геном может состоять из одной или из нескольких молекул ДНК, называемых хромосомами или плазмидами. Если гены, которые содержаться на дополнительной молекуле, необходимы клетке, то эта молекула называется минихромосомой, а если без них клетка может обойтись — то плазмидой.

Размеры молекул ДНК указывают в парах оснований, п.н. или bp (base pairs)

Для больших фрагментов используют т. п.н. или kb (kilo base)=103 bp и Mb (mega base)= 106 bp

Геномы бактерий — от 0.58 Mb у Micoplasma genitalium до 9.5 Mb у Myxococcus xanthus.

Как изучали геном бактерии. В середине двадцатого века был описан половой процесс у бактерий. Это процесс, при котором бактерии обмениваются своей генетической информации. На рисунке представлена схема этого процесса. Он называется конъюгацией. Во время конъюгации образуется цитоплазматический мостик, по которому происходит перенос молекулы ДНК из одной клетки в другую. У кишечной палочки имеется молекула ДНК, которая называется F-фактор (fertility factor — фактор плодовитости). Молекула F-фактора способна встроиться в геномную ДНК. В F-факторе кодируется специальный белок, который образует половые ворсинки, они называются F-пили. Эти самые ворсинки прикрепляются к другой клетке, которые F-фактор не содержат, и F-фактор инициирует репликацию. В процессе репликации образуется две копии молекулы ДНК, причем одна копия остается в исходной клетке, а вторая копия переносится в другую клетку. То есть, генетическая информация из одной клетки попадает в другую.

С ДНК, которая попала во вторую клетку происходит следующее. Хозяйская хромосома содержит такие же гены, как и тот кусок ДНК, который был перенесен в клетку. Однако варианты генов в исходной, донорной клетке, и в клетке-реципиенте могут отличаться. Например, в исходной клетке ген кодировал синтез фермента лактазы (расщепляет молочный сахар лактозу), а в рецепиенте такой же ген испорчен, то есть лактазу не кодирует из-за какой-то мутации. При этом бактерия не способна использовать сахар лактозу в среде.

Вновь прибывшая ДНК и хозяйская ДНК обмениваются гомологичными (то есть содержащими одинаковые гены) кусками. Образуется новое сочетание генов в хозяйской клетки. Среди ее старых генов оказывается встроен кусок с новым геном, прибывшим из клетки-донора. Этот процесс обмена кусками ДНК называется рекомбинацией. Та ДНК, которая в процессе рекомбинации оказалась не включенной в хромосому, деградирует и исчезает. Новый ген проявляет себя, клетка оказывается способной расщеплять тот сахар, который раньше использовать не могла. Это все детектируется исследователем. В такой ситуации ген лактазы называют генетическим «маркером», он маркирует участок хромосомы, связанный с определенным свойством бактерии (способностью расщеплять сахар, которую может детектировать исследователь).

Процесс репликации у кишечной палочки продолжается 20 минут, а процесс конъюгации длится 3–5 минут. За это время успевает перейти не вся хромосома, а только ее кусочек. Чем дольше длится конъюгация, тем больший кусочек успевает перейти из одной клетки в другую. Этот процесс позволяет определит какие маркеры поступили в клетку, если исходно клетки различались по нескольким генам. F-фактор способен встраиваться в разные участки хромосомы, и когда начинается передача, разные маркеры попадают в другую клетку. Проводили эксперимент. После конъюгации клетки встряхивали, и мостики между ними разрывались. Это встряхивание проводили через 2, 3, 5 минут, и смотрели, какие маркеры (и, соответственно, какой фрагмент хромосомы) за это время войдут. По этим данным строили генетическую карту (расположение друг относительно друга генетических маркеров). Генетическая карта кишечной палочки была построена в 60-х годах. На этой карте были гены-маркеры, расположенные по всей кольцевой хромосоме, а координаты генов на карте обозначались в минутах. Итоговая карта, построенная в 60-х годах, имела координаты в промежутке от 0 до 90 минут. Поэтому один известный микробиолог шутил, что кишечная палочка — это удивительный организм, у которой жизнь длится 20 минут, а половой процесс — 90 минут.

Построение такой карты было большим достижением, так как для кишечной палочки она была построена впервые; для других организмов существуют другие методы построения генетических карт, но все они основаны на рекомбинации. В начале 20-ого века были построены рекомбинационные карты для изучения генома мухи, а затем подобные карты стали использоваться для изучения генома человека.

Появились более точные технологии изучения генома бактерий, пределом точности является определение нуклеотидной последовательности, точнее карту построить невозможно. На этой карте расстояние обозначается уже не в минутах, а в парах нуклеотидов.

Метод определения последовательности нуклеотидов, или секвенирование, был разработан в 70-х годах. Две группы ученых независимо друг от друга разрабатывали эти методы. Один из них был разработан Сэнгером, второй — Максамом и Гилбертом, и все они получили в 1980 году Нобелевскую премию. До сих пор созданные ими принципы используются при секвенировании, сейчас уже проводимом не вручную, а автоматами.

В 1995 году был прочтен первый относительно небольшой геном бактерии Haemophilus influenzae. Это было огромным достижением, очень большой сенсацией. До этого удавалось определить полностью только геномы вирусов, которые на порядок меньше геномов бактерий. На настоящий момент полностью прочитаны геномы более 100 видов бактерий.

ЧТО УДАЕТСЯ УЗНАТЬ О БАКТЕРИЯХ ПО ИХ ГЕНОМУ

Состав генома (какие гены присутствуют)

Раньше, чтобы узнать что-то о бактерии, надо было долгие годы исследовать ее способность расщеплять те или иные сахара, другие питательные вещества, установить, какая температура оптимальная для ее роста, получить множество