Что за безумное стремленье! - Фрэнсис Крик

Может быть, Борис и сам в это не верил (я не поверил точно), но его вопрос заставил меня осознать, что сперва нам нужно продемонстрировать влияние единичной мутации в ядерном гене на аминокислотную последовательность белка, которую он кодирует, – возможно, изменение всего лишь одной аминокислоты. По возвращении в Кембридж я решил, что этим и нужно заняться на следующем этапе.

Какой организм использовать, какой белок изучать, было непонятно. Вскоре к нам в Кавендишскую лабораторию пришел работать Вернон Инграм. Его основная задача состояла в том, чтобы добавлять тяжелые атомы к молекулам гемоглобина или миоглобина для облегчения работ с дифракцией, но вместе с ним мы решили подступиться к генетической проблеме. Мы догадались, что на начальном этапе нам не нужно полное картографирование гена. Все, что нам требовалось, – чтобы генетической информации хватило для доказательства того, что мутация наследуется по-менделевски и, следовательно, относится к ядерному гену. Не требовалось и определять местоположение измененной аминокислоты в белковой последовательности. Нужно было лишь продемонстрировать, что в последовательности имеет место изменение, вызванное мутацией. Мы считали, что это облегчит задачу, поскольку в таком случае от нас требовалось всего лишь изучить аминокислотный состав белков. Если молекула белка была достаточно небольшой, при везении мы могли бы установить и совсем малое изменение, на уровне единственной аминокислоты.

Как наиболее легкодоступный для работы белок, мы выбрали лизоцим. Лизоцим – фермент, впервые описанный Александром Флемингом, первооткрывателем пенициллина; молекула его небольшая, по свойствам основная (то есть положительно заряженная). Флеминг доказал, что этот фермент присутствует в слезах и что его много в яичном белке. Он лизирует (разрушает) определенный класс бактерий и в обоих случаях служит защите от инфекции. Одна из бактерий к нему особенно чувствительна и потому может использоваться как тест на присутствие этого белка.

Основным объектом наших опытов был яичный белок, но мы пробовали работать и с человеческими слезами. Каждое утро, когда я приходил в лабораторию, лаборантка брала образец моих слез. Не будучи актером, я не мог так запросто заплакать по заказу, поэтому лаборантка подносила мне к глазу кусочек сырого лука. Я склонял голову набок, чтобы слеза не утекла в нос, и лаборантка ловила ее пастеровской пипеткой, когда она стекала с другого уголка глаза. И все равно было трудно получить больше одной-двух капель, хотя я обнаружил, что, если думать о грустном, это помогает. Как ни странно, печальные или трагические события не вызывают у меня непроизвольных слез, зато от хеппи-эндов я реву неудержимо. Допустим, невеста в финале торжественно шествует к алтарю под ликующие звуки органа. Я буду обливаться слезами, при этом сгорая от стыда.

Действие одной-единственной слезы поразительно. Слабая взвесь бактерий, которую мы использовали, на вид достаточно мутная, хотя и не такая густая, как молоко. Добавьте одну слезу, взболтайте пробирку, и в одно мгновение взвесь станет совершенно прозрачной. Все бактерии лизированы, поэтому резко упало рассеяние света, из-за которого жидкость выглядела мутной. Разумеется, мы использовали более точные количественные оценки, но в основе наших тестов лежало по существу то же явление.

Поскольку у куриного лизоцима сильный положительный заряд, в отличие от всех других белков яичного белка, можно кристаллизовать его в самом яичном белке, без последующей очистки. Биохимика поражает вид кристаллов, сидящих в загустевшем, клейком яичном белке. По этой же причине лизоцим можно было достаточно легко изолировать с помощью простейшей ионообменной колонки, которую как раз тогда разработали для фракционирования белков.

Я был бы рад похвалиться тем, что мы обнаружили мутантный ген, но на самом деле у нас ничего не вышло. Мы исследовали лизоцим довольно примитивными методами, рассматривая, по сути, его заряд и то, как он поглощает ультрафиолет, однако нам с ходу удалось показать, что куриный лизоцим отличается от лизоцима цесарок, а оба они, в свою очередь, – от лизоцима моих слез. Хотя мы изучили с десяток пород кур, любезно предоставленных здешним специалистом по генетике домашней птицы, и общим счетом около сотни яиц, мы так и не обнаружили никакой разницы между ними. Мы проанализировали слезы нескольких сотрудников лаборатории, но у всех они были похожи. Я захотел взять для анализа слезы моей младшей дочки Жаклин, которой тогда было два годика, но Одилия воспротивилась. Как! Использовать ее бесценное чадо для опытов! Мне было строго-настрого запрещено даже пытаться.

Наверное, мы бы продолжали в том же духе, но тут наступил прорыв. Макс Перуц занимался гемоглобинами, в том числе человеческим. За несколько лет до того Гарви Итано и Лайнус Полинг продемонстрировали, что гемоголобин человека, страдающего серповидноклеточной анемией, при электрофорезе ведет себя не так, как нормальный гемоглобин. Полинг верно определил, что это заболевание генетическое. Один из его коллег в Калифорнийском технологическом институте вычислил аминокислотный состав и сообщил о том, что различий между здоровым гемоглобином и гемоглобином при серповидноклеточной анемии нет. Это был дурно сформулированный вывод. Он имел в виду, что не смог заметить достоверной разницы в составе, но молекулы гемоглобина довольно крупные, так что при его приблизительной методике одну-единственную аминокислотную замену можно было запросто упустить.

Сэнгер изобрел метод, который он назвал пептидной дактилоскопией (fingerprinting proteins). Он разлагал белок с помощью фермента (трипсина), разрезающего полипептидную цепочку строго в определенных местах. Небольшое количество фрагментов пептидной цепи, полученное таким образом, подвергалось затем двумерной бумажной хроматографии, чтобы рассортировать их и разложить на бумаге. Вернон догадался, что это и есть тот метод, которого ему не хватало, чтобы отловить мелкие изменения в молекуле белка. Максу повезло получить гемоглобин больного серповидноклеточной анемией, и он поделился им с Верноном для анализов. К его радости, «отпечатки» пораженного и здорового гемоглобина отличались на одну позицию в одной из субъединиц белка.

Вернон сумел выделить измененный пептид, определить его последовательность и доказать, что разница вызвана заменой единственной аминокислоты. Валин заменял глутаминовую кислоту. Помнится, он сомневался, не две ли аминокислоты подверглись замене. Мы с Джимом в ту пору были менее сдержанны и не поверили. «Попробуйте еще раз, Вернон, – сказали мы ему, – вот увидите, замена всего одна». Так и оказалось.

Этот результат был неожиданным в двух отношениях. Серповидноклеточная анемия – болезнь, при которой мутантный гемоглобин, отдавая кислород в сосудах, образует кристаллы внутри эритроцитов (красных кровяных телец). От этого эритроцит часто рвется, поэтому больные испытывают хронический недостаток гемоглобина в крови и часто умирают, не дожив до двадцати. И это смертоносное воздействие оказывала крошечная замена в единственном из множества генов организма (теперь известно, что это замена всего одного основания, то есть нуклеотида). В сущности, испорчены всего две молекулы – одна унаследована от отца, вторая от матери. Как может такое малюсенькое изменение погубить чью-то жизнь? Все дело в каскаде нарастания. Каждый дефектный ген копируется много-много раз, ведь каждая клетка тела должна воспроизвести себя. Стало быть, у клеток – предшественников эритроцитов каждый ген копируется множество раз на матричную РНК, а каждая матричная РНК запускает синтез множества дефектных молекул белка. Крошечный дефект в расположении атомов ширится и ширится, пока в организме больного не накапливается много дефектного белка – достаточно, чтобы при неблагоприятных условиях вызвать смерть.