Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1 - Журнал «Домашняя лаборатория»

В отношении органогенеза Скугом и Мурасиге была выдвинута концепция, согласно которой можно получить образование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса, изменяя относительное содержание ауксинов и цитокининов. В самом простом случае (табак) индукция и образование каллуса наблюдается при сбалансированном отношении ауксинов к цитокининам, стеблевые почки образуются при повышении уровня цитокининов по отношению к ауксинам, корни формируются при высоком содержании ауксинов в среде. В большинстве случаев формирование органов в культуре клеток можно объяснить гормональной теорией регуляции, но для некоторых видов она оказывается несостоятельной. Одни и те же физиологически активные вещества регулируют и деление клеток при недифференцированном росте каллуса, и клеточные деления, связанные с дифференциацией. Если дифференциация включает изменения в экспрессии генов на уровне транскрипции, тогда должны существовать и другие специфические вещества, определяющие компетентность клетки к обработке экзогенными фитогормонами.

Есть системы, не реагирующие на гормональные обработки. Клетки этих тканей не способны к дифференциации, или, пролиферирующие in vitro, не проявляют тотипотентности. Морфогенная способность клона зависит от генотипа. Имеет значение и орган, от которого взят первичный эксплант. Ткани одного и того же органа имеют разную способность к морфогенезу. Например, флоэмная ткань корня моркови дает начало корням, а ксилемная — формирует эмбриоиды.

Для понимания механизмов морфогенеза необходимо рассмотреть комплекс морфофизиологических процессов, протекающих в каллусной ткани, так как эти процессы лежат в основе того, что из каллуса при определенных условиях выращивания дифференцируется растение. В процессе культивирования отмечено возникновение новых микротрубочек в клетке in vitro, изменение ее размеров, активности рибосом, состояния пластидных пигментов, запасающих веществ. Роль микротрубочек, микрофиламентов и других структур в клеточном взаимодействии пока не выяснена. Эти структурные образования появляются обычно при регенерации и каким-то образом причастны к клеточному делению, взаимодействию между клетками, структуро- и формообразованию. Изменяется также структура и активность аппарата Гольджи, который выполняет важную функцию при клеточном делении.

Появляются многоядерные клетки, отмечается полиплоидизация в результате нарушения митоза. Характерное несинхронное течение митотических циклов является одним из условий морфологической гетерогенности клеток ткани. Важно, что при выращивании in vitro наблюдается генетическая гетерогенность клеток, появление мутантов с отличительными особенностями органогенеза. В основе лежат изменения состояния хромосом в виде транслокаций, делеций, другие нарушения связаны с полиплоидизацией.

Клетка, введенная в культуру, претерпевает последовательные изменения: переход к дедифференцированному состоянию, эмбриональному росту и, благодаря способности каллуса к вторичной дифференциации, формообразованию. Взаимодействие между клетками выступает как решающий фактор их дифференциации и специализации. Процесс дифференциации клеток обусловлен различной степенью репрессии и дерепрессии генетической информации.

В ассоциации клеток каллусной ткани одни клетки занимают определенное положение и осуществляют посредством физико-химических контактов влияние на другие, чем определяется их структурно-функциональное состояние. Межклеточные взаимодействия осуществляются с помощью соответствующих донорно-акцепторных молекул цитоплазматической мембраны. Этими молекулами могут быть низкомолекулярные белки, комплексы углеводов с белками, фитогормоны, ингибиторы, полярные соединения и другие. Но во всех случаях на основе нуклеиново-белкового, белково-углеводного и иного типа узнавания они будут способствовать слипанию или отталкиванию клеток, будут выступать как эффекторы или апорепрессоры. В клетке реципиента с помощью специальных рецепторов эти молекулы будут связываться и изменять в эпигенезе реакцию генетической информации. Таким образом, в основе дифференциации клетки лежат процессы репрограммирования, репрессии, дерепрессии генетической информации. Это приводит к образованию специализированных клеток, которые становятся способными к взаимодействию, ассоциации, образованию геометрических форм, к органо- и морфогенезу.

Важнейшим условием морфогенеза является адгезия клеток, в результате которой образуется ткань и орган. Поверхностные рецепторы, а также различные структуры типа микротрубочек обуславливают узнавание, сближение, слипание клеток в процессе дифференциации, ткане- и формообразования. Вещества, активные в процессах структуро- и формообразования, синтезируются под контролем ядра при поступлении сигналов из цитоплазмы клетки, а также экзогенных импульсов, эффекторов. При этом связующим звеном между генетической информацией, ее реализацией и эффектором выступают аллостерические белки, которые собирают, накапливают внешнюю информацию и преобразуют ее, в результате чего изменяют свою конформацию и вступают во взаимодействие с опероном.

Генетическая обусловленность процессов морфогенеза отражается в изменении синтеза и-РНК, белков, активных ферментов, то есть в комплексе скоординированных во времени и пространстве реакций, обуславливающих дифференциацию активности генов. Появление некоторых белков свидетельствует об их участии в морфогенезе и запуске морфогенетических реакций. Установлен специфический фактор пептидной природы, стимулирующий морфогенез. Изучая генетический контроль каллусообразования и органогенеза, ученые предположили, что интенсивность образования каллуса находится под генетическим контролем.

О генетической обусловленности признака регенерации в условиях in vitro свидетельствуют следующие факты:

1. Отсутствие определенных плеч хромосом (например, в клетках Triticum timopheevii при длительном культивировании теряются плечи хромосом генома At) может приводить к снижению выхода регенерантов.

2. С помощью гибридизации можно повысить интенсивность регенерации в каллусной ткани.

3. Использование разных по составу питательных сред для регенерации способствует разному уровню экспрессии генов, которые определяют этот признак.

4. В основе генетического контроля таких признаков, как частота каллусообразования, частота образования морфогенных каллусов и количество зон регенерации для озимой пшеницы основными являются сверхдоминирование, неполное доминирование и эпистаз; для озимой твердой — эпистаз, неполное доминирование и сверхдоминирование; для яровой твердой — эпистаз.

Одни генетические системы контроля для всех признаков проявляются стабильно (эпистаз), а другие (сверхдоминирование) — значительно изменяются в зависимости от признаков и генотипов. Но следует отметить, что каллусогенез и регенерация растений не являются сопряженными процессами, вероятно, они контролируются различными генетическими механизмами. Общей закономерностью для культивируемых тканей остается возрастание цитогенетической вариабельности в процессе культивирования. С этим коррелирует в большинстве случаев потеря морфогенного потенциала. Способность к морфогенезу зависит и от состояния ядра. Как правило, регенерирующие в культуре тканей растения являются диплоидными, хотя ткани, из которых они произошли, имеют разный уровень плоидности.

Таким образом, для индукции морфогенеза in vitro необходимо вызвать неоднородность в клеточных популяциях и тканях. Любые воздействия, приводящие к увеличению неоднородности в культуре клеток, в пространственном распределении гормонов, будут способствовать дифференциации клеток и формообразованию в каллусе. Доказательством этого могут также служить эксперименты, проведенные с каллусной тканью пшеницы и кукурузы в космических условиях. Эти эксперименты были описаны М. Карабаевым (1994). В условиях космического полета можно выделить 2 принципиальных стадии клеточного ответа на экстремальные условия:

1. Эта стадия, или стадия адаптации, продолжается 10–12 дней и связана с адаптацией культуры к стрессу. Она сопровождается общим уменьшением жизнеспособности клеток и потерей значительного числа клеток. В этих условиях число жизнеспособных, стрессоустойчивых клеток постепенно возрастает.

2. Инициируется деление и меняется распределение клеток в популяции, уменьшается градиент элементов питательной среды, так же как и градиент продуктов жизнедеятельности клеток. Независимо от продолжительности космического поле та, развитие клеток и структур, ответственных за клеточную дифференциацию, эмбриогенез и регенерацию растений подавляется космическими условиями. Основная причина этого может быть связана