ДНК и её человек. Краткая история ДНК-идентификации - Елена Клещенко

Ионное полупроводниковое секвенирование, оно же секвенирование Ion Torrent и рН-опосредованное секвенирование, не использует ни меченых нуклеотидов, ни оптических датчиков. Присоединение очередного нуклеотида сопровождается высвобождением не только пирофосфата, но и протона Н+ – вот этот протон, точнее, локальное изменение рН на микрочипе, и регистрируется чувствительным датчиком.

Все эти методы на самом деле требуют присутствия множества копий молекулы-матрицы (и, соответственно, довольно сложной пробоподготовки). Но уже появилось секвенирование единичных молекул ДНК или РНК. Так, одномолекулярное секвенирование в реальном времени, разработанное компанией Pacific Biosciences, позволяет детектировать свечение единичного нуклеотида с флуоресцентной меткой, присоединяемого к цепочке. Важно, что таким методом можно читать очень длинные молекулы – десятки тысяч нуклеотидов, то есть не нужно разрезать ДНК на мелкие кусочки, а потом собирать.

А совсем недавно, всего несколько лет назад, появились приборы, использующие фантастически красивый метод – нанопоровое секвенирование. Это уже секвенирование третьего поколения! Представьте себе реакционную камеру с раствором электролита, разделенную на две части мембраной. В мембране есть маленькая пора, по размеру такая же, как те, через которые молекулы транспортируются в живую клетку. Между двумя половинами камеры имеется разность потенциалов, из-за чего возникает ток ионов через пору. А когда через эту пору проходит молекула ДНК (она проникает туда под действием напряжения, как при электрофорезе, или ее направляет специальный фермент) – тогда азотистые основания А, Т, G, С по-разному перекрывают просвет поры, сила тока падает и снова возрастает, ее колебания можно регистрировать и таким образом получить последовательность нуклеотидов. Своего рода молекулярная морзянка.

Приборы для нанопорового секвенирования продает британская компания Oxford Nanopore Technologies. Совершенствовать эту технологию непросто, уровень ошибок не сразу удалось снизить до приемлемого, но сейчас приборы Oxford Nanopore уже и в космос слетали, и в России появились. Например, многие видели в новостях трогательно маленький “секвенатор-флешку” MinION, подключаемый к ноутбуку через USB, – эта игрушечка может за один запуск секвенировать геном человека с шестикратным покрытием. А рекордная длина прочтения с одной молекулы, как сообщается на сайте компании, – 2,2 млн нуклеотидов. Два миллиона за один проход! Да, это вам не полиакриламидный гель.

Здесь перечислены не все существующие методы. Есть множество их вариаций. Есть еще и полони-секвенирование, оно же лигазное, оно же SOLiD, – коротко объяснить принцип данного весьма полезного метода тут не получится. Есть Nanoball Sequencing, что можно перевести как секвенирование ДНК-наношаров…

В общем, мало кто сомневается, что секвенирование будет становиться все доступнее по цене. Некоторые наши бабушки и дедушки ходили за покупками с дозиметрами и “измерителями содержания нитратов”. Возможно, из наших сверстников получатся ответственные пенсионеры, которые будут брать с собой на рынок портативный секвенатор и, сурово поглядывая на продавца сквозь гугл-очки, проверять подозрительно розовый помидор на присутствие генных модификаций, неизвестных Роспотребнадзору.

Шутки шутками, но современные методы секвенирования в самом скором времени изменят нашу жизнь. (Как именно – тема для отдельной книги.) Технологии NGS позволяют прочесть больше нуклеотидов в единицу времени и за меньшие деньги, в этом смысле прогресс налицо. Тем не менее секвенирование по Сенгеру остается золотым стандартом. Метод Сенгера читает без перерыва более длинные фрагменты с меньшим количеством ошибок. Часто и в современных научных работах можно встретить фразу, что, мол, мы нашли такие-то мутации с помощью NGS и затем подтвердили находку методом Сенгера.

Но еще до того, как секвенирование стало более или менее рутинной задачей – и даже до того, как был начат проект “Геном человека”, и задолго до появления высокопроизводительного секвенирования! – анализ ДНК нашел применение в криминалистике. Теперь нам часто придется забегать вперед и возвращаться назад, в начале 1980-х слишком много интересного происходило одновременно.

Осенью 1983 г. в английском городке Нарборо графства Лестершир нашли мертвой 15-летнюю Линду Манн. Три года спустя в другом городке под названием Эндерби, недалеко от Нарборо, была изнасилована и задушена 15-летняя Дон Эшворт. Полиция имела основания полагать, что обеих девушек убил один и тот же человек. По второму делу проходил 17-летний подозреваемый, он давал признательные показания, но отрицал, что убил первую девушку. Участвовать в расследовании пригласили генетика Алека Джеффриса из Лестерского университета, создателя нового метода идентификации личности – ДНК-фингерпринта (от fingerprint – отпечаток пальца). Метод позволял сравнивать образцы ДНК и устанавливать, принадлежат ли они одному человеку или разным. Он еще не был испробован в уголовных делах, но как раз подходил для данного случая: следствие располагало образцами биоматериала преступника (то есть спермы), имелся и подозреваемый. Так что скажет наука: он или не он?..

Сэр Алек Джеффрис, член Лондонского королевского общества, лауреат премии Альберта Эйнштейна, Кавалер Почета (этим орденом могут обладать не более 65 ныне живущих граждан Великобритании и Содружества) и т. д. и т. п. – нечасто на профессора генетики проливается такой дождь наград. Причина в том, что с открытия, которое он сделал, началась новая глава в истории криминалистики. Увлекательные попытки угадать, кому принадлежит пятно крови – преступнику, жертве или раненому животному, – уходят в прошлое. Теперь мы можем узнать точно.

Алек Джеффрис родился в 1950 г. Его папа и дедушка по отцовской линии были изобретателями – дед, например, изобрел “Трехмерный фотоскульптурный процесс Джеффриса”, способ изготовления бюста человека по фотографиям, наделавший много шума в 1930-е гг.; даже у премьер-министра Невилла Чемберлена был такой бюст.

Когда Алеку исполнилось восемь, отец подарил ребенку набор юного химика, в котором был даже флакончик с серной кислотой – с современной точки зрения удивительно легкомысленный подарок, но тогда восьмилеток считали более дееспособными, чем сейчас считают старшеклассников. Ожог от кислоты оставил на лице Алека шрам, который ныне скрывает борода. А еще папа купил ему старинный микроскоп. В 12 лет Алек с увлечением анатомировал насекомых. Как он сам потом вспоминал, родители к его хобби относились с пониманием, но ровно до тех пор, пока ребенок от шмелей не перешел к млекопитающим: зарабатывая доставкой газет, он нашел на дороге дохлую кошку, принес домой и выложил с исследовательскими целями на обеденный стол.