ДНК и её человек. Краткая история ДНК-идентификации - Елена Клещенко

Затем проводили экстракцию ДНК. От успеха на этом этапе зависела судьба всего исследования. Поэтому все процедуры велись со строжайшим соблюдением стерильности, со всеми мыслимыми контролями, в помещениях, где ранее не работали с человеческой ДНК, а саму экстракцию для каждого образца повторяли несколько раз. Необходима была полная уверенность, что будет амплифицироваться и секвенироваться именно ДНК членов царской семьи, а не кого-то из наших современников. Для вящей достоверности экстракцию проводили в двух разных научных центрах: в московском Институте общей генетики РАН и в Медицинской школе университета Массачусетса.

Человеческая ДНК составляла менее процента от общего количества, выделенного из образцов 146 и 147, остальное – ДНК микроорганизмов. Но это не помешало дальнейшей работе: системы анализа митохондриальной ДНК, Y-хромосомы и неполовых хромосом ориентированы на последовательности, специфичные для человека, они просто “не замечают” ДНК других видов. Иначе судмедэксперты столкнулись бы с непреодолимыми трудностями даже при расследовании рутинных уголовных дел.

Если сравнить, как это часто делают, секвенирование ДНК с чтением книги, то в данном случае перед исследователями были обожженные клочки страниц. К счастью, не предполагалось, что текст этих книг совершенно уникален и доселе не читался (в отличие, например, от геномов ископаемых видов). Большинство генов у всех людей одинаковы, индивидуальные отличия составляют доли процента, да и многие вариации подчиняются известным закономерностям. Методы идентификации человека и установления родственных связей по ДНК в то время были прекрасно отработаны. Тем не менее случай был исключительно трудным, к тому же работе заранее было обеспечено повышенное внимание общественности и как следствие – повышенные требования к качеству результатов.

Естественно, и Рогаев с соавторами анализировали митохондриальную ДНК: она сохраняется лучше ядерной, и по ней существуют обширные базы данных, показывающие популяционную изменчивость. В первую очередь нужно было секвенировать гипервариабельные участки – HVR1 и HVR2, в которых сосредоточено особенно много индивидуальных различий, – и убедиться, что с полученной ДНК вообще можно работать. Последовательности ДНК из образцов 146 и 147 буква в букву совпали с образцами 7, 3, 5, 6, а также с ранее опубликованной мтДНК принца Филиппа.

Успех вдохновил исследователей на смелую идею: почему бы не реконструировать полную последовательность митохондриальной ДНК царицы и ее детей? И это было сделано. Разработали специальные праймеры для амплификации отдельных перекрывающихся участков мтДНК. Существующие методики не годились, так как не были рассчитаны на амплификацию ДНК, состоящей из обрывков. Пришлось использовать много хитрых приемов, уменьшающих вероятность потери какого-либо фрагмента. В итоге для образцов 7, 146 и 147 (царица, Мария и Алексей) удалось получить полную последовательность митохондриальной ДНК длиной 16 571 нуклеотид.

Митохондриальная ДНК Александры Федоровны и ее детей – это, как мы уже говорили, мтДНК королевы Виктории, “бабушки королей”. И чтобы окончательно убедиться в достоверности результата, следовало сравнить полученную последовательность с мтДНК ныне живущих потомков Виктории по женской линии – детей ее дочек, внучек и правнучек.

Снова обратились с просьбой к принцу Филиппу, но он ответил, что уже давал свою кровь ученым в 1990-х, результаты исследования опубликованы и желающие могут с ними ознакомиться. Однако в работе, которой гарантирована пристрастная критика, не хотелось полагаться на литературные данные. Исследователи нашли других прямых потомков, не столь знаменитых, как британский принц. Удалось разыскать представителей двух независимых линий: дочку и внучку сестры принца Филиппа и правнучку с праправнучкой принцессы Беатрисы, родной тети Александры Федоровны. Это могло помочь идентифицировать случайную мутацию, если бы она имела место. Но анализ показал полное совпадение. В могилах под Екатеринбургом действительно лежали внучка, правнучки и правнук английской королевы. А последовательность, которая получила название Queen Victoria mitotype, авторы работы поместили в банк данных. Интересно будет проследить ее дальнейшую судьбу в популяциях.

Митохондриальную ДНК из образца 4 (Николай II) также реконструировали полностью и сравнили с мтДНК родственников по материнской линии его сестер. Она была на два нуклеотида короче, чем у императрицы и детей, а единственное несовпадение у Николая с ныне живущей его правнучатой племянницей (Ксенией Шереметевой-Сфири, которая участвовала и в предыдущем исследовании) было за счет все той же гетероплазмии в гипервариабельной области, в позиции 16 169.

Гетероплазмию у членов дома Романовых, как упоминалось выше, обнаружили еще Павел Иванов с Питером Гиллом. У Николая в этом положении был либо тимин, либо цитозин – то есть митохондрии одного человека не были генетически идентичными, геномы разных митохондрий отличались на одну букву, – и такая же картина была у его брата, великого князя Георгия, а вот у Ксении, правнучки Ксении Александровны, там было четкое Т. Но группа Евгения Рогаева получила дополнительную интересную информацию: у сына другой сестры Николая, Ольги – Тихона Куликовского-Романова, проживавшего в Канаде, – в этой позиции оказался цитозин.

С Тихоном Куликовским-Романовым была отдельная драматическая история. В свое время он отказался предоставить свою кровь для исследования Иванову и Гиллу и в резких выражениях заявил о своем недоверии к ним. Однако образец крови завещал своей жене, а Ольга Куликовская была более милостива к Евгению Рогаеву, чем к другим экспертам: ему было позволено исследовать ДНК племянника императора. Результат был положительным: все совпало, кроме того самого цитозина.

Итак: люди, чьи обугленные кости найдены в “екатеринбургском могильнике”, – родственники королевы Виктории, императрицы Марии Федоровны, родственники ныне живущих представителей королевских домов. Довольно ли вам этого? Нет, отвечают скептики. У них возникает вопрос: а вправду ли митотипы королевы Виктории и принцессы Дагмары уникальны и присущи только их кровным родственникам? Может быть, таких митотипов в уральской популяции полно? Дело осложнялось тем, что американские и российские базы данных не очень хорошо подходили для определения частот встречаемости западноевропейских мтДНК.

Чтобы отвести это возражение, авторы работы создали собственную базу данных, в которую включили этнические группы, проживающие на территории России, а также европейскую популяцию – немцев, англичан и т. д. Совпадений не было обнаружено.

Интересно, что даже в более обширной мировой базе (71 000 человек) нашелся всего один индивид с полным совпадением по гипервариабельному участку. Эта женщина, проживающая в Канаде, была несколько встревожена, когда узнала о своем возможном родстве с королевскими домами Европы. (И в самом деле, среди ее предков были немцы.) Однако когда у этой женщины взяли образец ДНК, оказалось, что ни второй гипервариабельный участок, ни полная последовательность мтДНК у нее не имеют ничего общего с митотипом королевы Виктории. Версию “случайного” появления именно такого митотипа на Урале можно с чистой совестью отбросить.